多重病原菌檢測(cè)是一種先進(jìn)的診斷技術(shù)，它能夠同時(shí)檢測(cè)和識(shí)別多種病原體，包括細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲等。這種檢測(cè)方法在感染性疾病的診斷中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，特別是在病原體多樣且復(fù)雜的情況下，能夠快速準(zhǔn)確地確定病原體，從而制定有效的治療方案。

病原宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)（mNGS）作為一種新型的基因水平檢測(cè)技術(shù)，無(wú)需預(yù)設(shè)、無(wú)需培養(yǎng)、無(wú)偏好性，能夠全面檢測(cè)標(biāo)本中的所原體遺傳物質(zhì)（包括DNA和RNA），并進(jìn)行高通量測(cè)序。基于生物信息學(xué)算法，該技術(shù)可以與病原數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定樣本中病原微生物的種類及功能信息，為臨床抗感染提供精準(zhǔn)的病原學(xué)證據(jù)。

為了規(guī)范病原宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)在臨床本地化檢測(cè)中的應(yīng)用，中國(guó)藥師協(xié)會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)細(xì)菌感染與耐藥防治分會(huì)、國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床抗微生物藥物敏感性折點(diǎn)研究和標(biāo)準(zhǔn)制定專家委員會(huì)等機(jī)構(gòu)，于2024年1月在《中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志》聯(lián)合發(fā)表了《病原宏基因組高通量測(cè)序臨床本地化檢測(cè)規(guī)范專家共識(shí)》。該共識(shí)在實(shí)驗(yàn)室符合國(guó)家相關(guān)政策法規(guī)以及保證檢測(cè)方法性能可靠的前提下，對(duì)如何在本地開(kāi)展mNGS檢測(cè)提出了具體指導(dǎo)意見(jiàn)。

干實(shí)驗(yàn)的性能確認(rèn)

當(dāng)生物信息學(xué)分析流程建立后，需對(duì)其進(jìn)行性能確認(rèn)，可以通過(guò)三類數(shù)據(jù)集進(jìn)行：（1）臨床標(biāo)本測(cè)序數(shù)據(jù)集：注釋充分、特征明確的臨床標(biāo)本測(cè)序數(shù)據(jù)（FASTQ或其他格式）；（2）計(jì)算機(jī)模擬測(cè)序數(shù)據(jù)：利用序列模擬軟件模擬生成測(cè)序數(shù)據(jù)集，要求既要具有與真實(shí)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量相同/相似的技術(shù)參數(shù)（文庫(kù)片段長(zhǎng)度分布、測(cè)序模式、測(cè)序錯(cuò)誤類型及頻率、測(cè)序質(zhì)量值、測(cè)序深度等），也要盡可能對(duì)臨床標(biāo)本的背景成分信息如宿主核酸、微生物和試劑背景核酸等進(jìn)行模擬；（3）組合數(shù)據(jù)集：利用序列模擬軟件定量模擬一種或多種目標(biāo)病原體的測(cè)序數(shù)據(jù)，然后將模擬序列添加到目標(biāo)病原體陰性標(biāo)本的真實(shí)測(cè)序數(shù)據(jù)中，形成接近臨床標(biāo)本的模擬數(shù)據(jù)集。利用上述數(shù)據(jù)開(kāi)展性能確認(rèn)，確定干實(shí)驗(yàn)流程的主要性能指標(biāo)，包括準(zhǔn)確率、精確率、召回率和 F1-Score（即精確度和召回率的調(diào)和平均值）等。如果在比對(duì)過(guò)程中出現(xiàn)寄生蟲的假陽(yáng)性結(jié)果（寄生蟲為真核生物，與宿主序列相似度較高，且部分寄生蟲基因組數(shù)據(jù)中存在人源序列的污染），需要考慮設(shè)置更高的陽(yáng)性匯報(bào)閾值或者對(duì)相應(yīng)寄生蟲的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行清洗。常見(jiàn)的寄生蟲匯報(bào)閾值為與陰性對(duì)照相比RPM 達(dá)到 10 倍以上，基因組數(shù)據(jù)清洗常采用把目標(biāo)寄生蟲基因組單獨(dú)與人基因組比對(duì)并去除高度同源的序列。

全流程的性能確認(rèn)

確認(rèn) mNGS 濕實(shí)驗(yàn)和干實(shí)驗(yàn)全流程對(duì)病原體的檢測(cè)能力是否能夠達(dá)到臨床預(yù)期用途。在全流程性能確認(rèn)中至少應(yīng)包括革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、分枝桿菌、絲狀真菌、酵母菌、DNA 病毒、RNA病毒、寄生蟲，同時(shí)應(yīng)關(guān)注胞內(nèi)菌和難破壁的病原微生物。

性能確認(rèn)參數(shù)可參考《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》、《臨床微生物培養(yǎng)、鑒定和藥敏檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證》、《病原宏基因組高通量測(cè)序性能確認(rèn)方案》等，建議實(shí)驗(yàn)室 mNGS 檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)對(duì)方法符合率、交叉反應(yīng)、精密度、準(zhǔn)確度、檢出限、抗干擾能力（如針對(duì)高人源標(biāo)本）、穩(wěn)定性等性能參數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。

樣品盤的制備

樣品盤要包含模擬參考品和已知病原檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)臨床標(biāo)本。樣品盤的設(shè)置應(yīng)嚴(yán)格遵循臨床預(yù)期用途所涉及的標(biāo)本類型，所含微生物應(yīng)有代表性，盡可能覆蓋預(yù)期用途中的病原體。標(biāo)準(zhǔn)微生物菌株可以選用ATCC或CMCC菌株等。應(yīng)根據(jù)不同標(biāo)本類型來(lái)合理地設(shè)置模擬參考品中的人源細(xì)胞濃度（如支氣管肺泡灌洗液的人源細(xì)胞濃度中位數(shù)為 10⁵cells/ml）。模擬參考品中應(yīng)至少包含革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、絲狀真菌、酵母菌、分枝桿菌、DNA 病毒、RNA 病毒、寄生蟲共 8 類病原微生物。在制備模擬參考品前，針對(duì)所有待投入微生物進(jìn)行檢出限（limit of detection， LoD）研究并確認(rèn)是否能滿足預(yù)期用途中對(duì)檢測(cè)性能的要求。

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